雷三林  趙華  馮大作  司中洲 (中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院　湖南 長(zhǎng)沙 410011)

【摘要】目的  探討E-cadherin和CD44V6在大腸癌患者大腸黏膜組織中的表達(dá)及其意義。方法  應(yīng)用免疫組織化學(xué)標(biāo)記鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶方法，對(duì)52例大腸癌患者癌組織中E-cadherin和CD44V6蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果  E-cadherin和CD44V6在大腸癌組織中的表達(dá)陽性率分別為59.6%和57.7%, E-cadherin和CD44V6的異常表達(dá)與大腸癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期顯著相關(guān)(P<0.05)。E-cadherin蛋白高表達(dá)者3年生存率為62.3%，而低表達(dá)者為37.7% CD44V6蛋白表達(dá)陽性者5年生存率為36 .7%，而陰性者為63.3%，陽性表達(dá)者與陰性表達(dá)者生存率差別有顯著性意義(P <0.05)。E-cadherin與CD44V6蛋白的表達(dá)陽性率呈負(fù)相關(guān)(P <0.05)。結(jié)論    E-cadherin和CD44V6與大腸癌的進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的指標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】大腸癌  轉(zhuǎn)移  E-cadherin  蛋白  cd44V6  免疫組織化學(xué)
Expression and significance of E-cadherin和CD44V6 in colorectal carcinoma. LEI San-lin ZHAO Hua FENG Da-Zuo ,et al. XiangYa Second Hospital OF The Central South University , Changsha Hunan，410011 China.
【Abstract】 Objective  To investigate the expression and significance of E-cadherin (E-cad)，CD44V6in colorectal carcinoma. Methods E-cad and CD44V6 were detected by streptavidin-biotin immunohistochemical methods in 52 cases of colorectal cancer tissue. Results  The high expression rates of E-cad were 59. 6% and CD44V6 were 43. 8% in colorectal carcinoma tissue. Significant correlation existed among the abnormal expression of E-cad and CD44V6，the depth of tumor invasion，lymphnode metastasis，and Dukes stages(P<0.05). Furthermore，the abnormal expression of CD44V6 was closely associated with the grade of differentiation(P<0.05).There was a positive correlation between the expression of E-cad and CD44V6; The 5 years survival rate of patients with the high expression of E-cad  was 65.6%, those with the low expression  was 28.8%, while there was a significant different with them (p>0 .05). Conclusion  The expression of E-cad and CD44V6 were closely associated with metastasis and development  of the colorectal carcinoma. Detection of the expression of E-cad  and CD44V6 protein in colorectal cancer might served as important prognostic predictors.
【key words】colorectal carcinoma; tumor metastasis; E-cadherin protein; lmmunohistochemistry;
 
　　大腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見惡性腫瘤之一。近年來，其發(fā)病率明顯增加，發(fā)病年齡提前。大腸癌的轉(zhuǎn)移是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，涉及到多種因子的異常改變。我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)黏附分子E-cadherin和CD44V6蛋白在大腸癌患者中的表達(dá)，并對(duì)其與大腸癌患者臨床、病理特征和生存期的關(guān)系進(jìn)行了分析，希望能對(duì)臨床治療和隨訪提供幫助。

1 對(duì)象和方法
　　1.1 對(duì)象資料  52份大腸癌標(biāo)本取自1996~2000年間在我院行大腸癌切除術(shù)的患者。所有患者術(shù)前均未接受過放療和化療，均有完整的隨訪資料。年齡27~86歲，中位年齡53歲，其中男性32例，女性20例。組織學(xué)分型:高一中分化腺癌33例，低分化腺癌19，其中黏液腺癌8例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例, 無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。Duke分期為A 期8例、B期16、C期28例。另取20例正常大腸粘膜活檢標(biāo)本作正常對(duì)照。
　　1.2檢測(cè)方法   采用免疫組織化學(xué)標(biāo)記鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶方法(SP法)檢測(cè)。S-P試劑盒和鼠抗人CD44V6單克隆抗體2F10(1:70)為ONCOGENE,SCIENCE公司產(chǎn)品，鼠抗人E-Cad單抗(4A2C7)購自北京中山生物技術(shù)公司。染色步驟按說明書進(jìn)行.以PBS代替作陰性對(duì)照。以已知陽性片作陽性對(duì)照。
　　1.3 染色結(jié)果判定方法  由兩位病理醫(yī)師對(duì)染色結(jié)果作出判定。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取其均值，CD44V6染色主要位于細(xì)胞漿及部分細(xì)胞核，呈紅色彌漫性分布， E-cadherin染色為紅色，位于細(xì)胞漿及細(xì)胞膜，細(xì)胞核很少見染色。根據(jù)染色強(qiáng)度及顯色細(xì)胞比例，將染色結(jié)果分為－、+、++三級(jí)。①按切片中細(xì)胞有無顯色及深淺評(píng)分，無顯色為0分、淺紅色為1分，深紅色為2分。據(jù)顯色細(xì)胞比例評(píng)分: 0%～10%為0分，11%～30%為1分，31%～70%為2分，>71%為3分。以上2種評(píng)分之和為每例的積分，按積分高低分為:0分為陰性(一)，0～2分為低表達(dá)，3～5分為高表達(dá)。
　　1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法　采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)或Fisher’s確切概率法，等級(jí)分組資料用秩和檢驗(yàn);生存率之間的比較用Wilcoxon檢驗(yàn)。

2 結(jié)果
　　2.1 E-cadherin和CD44V6在大腸癌中的表達(dá)狀況及意義　52例大腸癌中CD44V6表達(dá)陽性率57.7%(30/52)。28例轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中CD44V6陽性率89.3%(25/28)，其原發(fā)瘤中陽性表達(dá)為75%(21/28);無轉(zhuǎn)移者為37.5%(9/24)，CD44V6陽性表達(dá)在DukesC/D期腫瘤中高于A，B期(P<0.01)，兩者間差異有顯著性 (P <0.01)。52例大腸癌原發(fā)灶中E-cadherin高表達(dá)59.6%(31/52)，低表達(dá)40.4%(21/52)。在伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)瘤中E-cadherin低表達(dá)率為60.7%(17/28)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中低表達(dá)率為50％（14/28）而無轉(zhuǎn)移者僅為16.7%(4/24)，DukesC/D期腫瘤的E-cadherin低表達(dá)多于A，B期(P <0 .01)，兩者間有顯著性差異(P <0.01)。(圖1、圖2)。
　　2.2 不同臨床、病理特征大腸癌患者CD44V6和E-cadherin蛋白表達(dá)陽性率的比較   52例大腸癌標(biāo)本中，CD44V6陽性30例，占57.7%; E-cadherin高表達(dá)31例，占59.6%。兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P <0.05)(表1)。兩者表達(dá)陽性率均與患者年齡、性別和腫瘤大小無關(guān)(P >0.05)，與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況及DUKES分期有關(guān)(P <0.05)(表2)
　　2.3 不同CD44V6和E-cadherin蛋白表達(dá)狀況患者5年生存率比較   CD44V6蛋白表達(dá)陽性患者的5年生存率為36.7%(11/30)，CD44V6蛋白表達(dá)陰性患者5年生存率為63.6％(14/22); E-cadherin蛋白高表達(dá)患者的5年生存率67 .7%(21/31)，低表達(dá)患者為42.8%(9/21)，CD44V6陰性、E-cadherin高表達(dá)的患者5年生存率均高于CD44V6陽性、E-cadherin低表達(dá)表達(dá)者，差別有顯著性 (P<0.05)

　　　　　

3 討論
　　E-Cadherin是一種廣泛分布于上皮細(xì)胞的鈣依賴性糖蛋白。主要介導(dǎo)同種細(xì)胞間的黏附反應(yīng)，并起細(xì)胞骨架作用。E-Cadherin是調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間黏附反應(yīng)的重要媒介，對(duì)維持組織結(jié)構(gòu)形態(tài)起重要作用，因其可通過促進(jìn)同型細(xì)胞間的黏附，使癌細(xì)胞間保持密切接觸，難以脫離原發(fā)灶進(jìn)入周圍組織和脈管，被認(rèn)為是一個(gè)重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因 [1]。 近年來研究證實(shí)，E-Cadherin陽性表達(dá)的癌細(xì)胞的黏附能力強(qiáng)于陰性者，對(duì)陰性者E-Cadherin抗體不能產(chǎn)生對(duì)其黏附性的影響。E-Cadherin活性減弱可引起細(xì)胞與細(xì)胞間黏附破壞。而E-Cadherin的過度表達(dá)可引起細(xì)胞黏附性增強(qiáng)。E-Cadherin表達(dá)下降或缺失，細(xì)胞間的相互黏附力減弱，造成腫瘤細(xì)胞容易分散而向外浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，脫離原發(fā)灶而發(fā)生轉(zhuǎn)移[2]。本研究發(fā)現(xiàn)E-Cadherin低表達(dá)的大腸癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高達(dá)60.7%(17/28)，可能是由于E-Cadherin的改變導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)這兩種因素。說明增殖力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞通過E-Cadherin的改變獲得轉(zhuǎn)移表型，促使轉(zhuǎn)移形成。與Mayor，Kanazawa等的研究一致[3,4]。但我們發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移灶中E-Cadherin的表達(dá)與原發(fā)灶并不一致，與原發(fā)灶相比低表達(dá)率下降，這可能與原發(fā)灶中腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性有關(guān)，原發(fā)腫瘤因E-Cad表達(dá)水平下調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移的啟動(dòng)有關(guān)，而腫瘤在轉(zhuǎn)移灶需要保持E-Cad高表達(dá)，有利于癌細(xì)胞相互連接并形成轉(zhuǎn)移灶[4]。CD44是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附，通過其v區(qū)外顯子選擇性剪接產(chǎn)生多種不同的變異體，其中以含有外顯子V6的CD44變異體與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系密切，其機(jī)理可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞之間以及內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附和去黏附，而且還可能通過透明質(zhì)酸作為信號(hào)傳導(dǎo)分子調(diào)控淋巴管新生過程[5,6]。本研究發(fā)現(xiàn)CD44表達(dá)在Duckes C/D期較A、B期高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較無轉(zhuǎn)移者高，表明CD44V6與大腸癌惡性進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　腫瘤轉(zhuǎn)移涉及多種相關(guān)因子的調(diào)控，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的激活和轉(zhuǎn)移抑制相關(guān)因子的失活，均可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)CD44陽性表達(dá)和E-Cadherin低表達(dá)的大腸癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高達(dá)87.5%，可能是由于CD44V6分子介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞與淋巴結(jié)的特異性受體的粘附及E-Cadherin的改變導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，此外CD44V6有多種生物效應(yīng)，它的異常表達(dá)可擾亂E-Cadherin黏附功能，繼而發(fā)生癌細(xì)胞侵襲[7]。說明增殖力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞通過CD44V6和E-Cadherin的改變獲得轉(zhuǎn)移表型，促使轉(zhuǎn)移形成。
　　本研究發(fā)現(xiàn)E-Cadherin和CD44V6在大腸癌組織的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，E-Cad低表達(dá)、CD44V6高表達(dá)大腸癌組織分化差、DUKES分期高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高、患者生存率低，本研究結(jié)果提示，E-Cadherin和CD44V6的檢測(cè)，對(duì)大腸癌患者的術(shù)式選擇、切除范圍有指導(dǎo)意義，并可估計(jì)大腸癌的預(yù)后，為今后開展的基因治療積累更多的臨床資料。

參考文獻(xiàn)
[1]  Shiozaki H，Oka H，Lnoue M，et al . E-cadherin mediated adhesio